LE STRESS OXYDANT

I. Introduction
II. Définition du stress oxydant

1. le paradoxe de l’oxygène
2. les défenses antioxydantes
3. facteurs contribuant à augmenter le stress oxydant
4. une alimentation déséquilibrée : un facteur de stress oxydant important
5. utilité de mesurer son statut de stress oxydant

III. Comment évaluer son statut de stress oxydant ?

1. Antioxydants enzymatiques et de bas poids moléculaire

A. les superoxydes dismutases (SOD’s)
B. les glutathion peroxydases (GPx)
C. les thiorédoxines (TRx) et la thiorédoxine réductase (TRxR)
D. la hème oxygénase
E. les protéines de stress thermique
F. les caroténoïdes
G. la vitamine C
H. la vitamine E
I. le glutathion
J. les protéines thiols
K. l’acide urique
L. le coenzyme Q10
M. la capacité antioxydante globale

2. Les oligo – éléments

A. le sélénium
B. le cuivre
C. le zinc

3. Les marqueurs biologiques du stress oxydant

A. la peroxydation lipidique
B. les protéines oxydées
C. la 8-hydroxy-2’-déoxyguanosine

4. Le statut en fer

A. le fer libre
B. la ferritine
C. la transferrine et sa capacité de saturation en fer

5. Le radical monoxyde d’azote

6. La résonance paramagnétique électronique

7. Autres marqueurs

A. l’homocystéine
B. le glucose
C. la myéloperoxydase
D. le profil des acides gras

IV. Quel est le meilleur marqueur pour évaluer le stress oxydant ?

V. Traitement immédiat des échantillons et chaîne du froid : deux éléments indispensables pour obtenir des résultats de qualité

VI. Les développements futurs : la génomique et la protéomique

VII. Conclusions


VIII. Bibliographie

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Comment évaluer votre état de stress oxydant ?

I.Introduction


En condition physiologique, l’oxygène, élément indispensable à la vie, produit en permanence au niveau de la mitochondrie des espèces oxygénées activées (EOA) particulièrement toxiques pour l’intégrité cellulaire. Ces EOA, dont font partie les radicaux libres, sont dotées de propriétés oxydantes qui les amènent à réagir, dans l’environnement où elles sont produites, avec toute une série de substrats biologiques (lipides, protéines, ADN, glucose,..). Au niveau moléculaire, les EOA peuvent aussi agir comme messagers secondaires et activer différents facteurs ou gènes impliqués dans le développement de diverses pathologies.

Pour se protéger contre cet effet toxique de l’oxygène, l’organisme a développé des systèmes de défense qui permettent de réguler la production des EOA. Ces systèmes sont composés d’antioxydants (e.g : le groupe des vitamines A, C et E), d’oligo-éléments et de protéines qui empêcheront le fer de déclencher une production d’EOA. Des enzymes protéolytiques dont le rôle consiste à dégrader les substrats oxydés, complètent cette panoplie.

Les EOA sont également générées sous l’effet d’oxydants environnementaux. En effet, la vie moderne nous confronte à la pollution, l’absorption d’alcool ou de médicaments, l’exposition prolongée au soleil et au tabagisme qui sont d’autant de situations qui provoquent une surproduction d’EOA dans notre organisme. Ceci conduit à un affaiblissement de nos défenses antioxydantes (vitamines, oligo-éléments) mais également à l’apparition de dégâts cellulaires. La situation se complique car l’alimentation actuelle n’est plus suffisamment saine et équilibrée et de ce fait nous apporte de moins en moins d’antioxydants naturels nécessaires pour contrôler les effets nocifs de l’oxygène. Signalons aussi qu’un exercice physique intense mal pratiqué ou mal géré peut générer un stress oxydant. En situation clinique, le stress oxydant peut se développer lors d’une chirurgie cardio-vasculaire, d’une transplantation d’organes ou d’une détresse respiratoire.

De manière générale, le stress oxydant se définit comme étant le résultat d’un déséquilibre entre la balance des prooxydants et les systèmes de défense (antioxydants), avec comme conséquence, l’apparition de dégâts souvent irréversibles pour la cellule (figure 1).

figure 1 : déséquilibre de la balance entre
antioxydants et pro – oxydants

Chaque individu ne possède pas le même potentiel antioxydant en fonction de son mode de vie, de ses caractéristiques génétiques ou de l'environnement dans lequel il vit. Les bonnes habitudes alimentaires jouent aussi un rôle primordial dans le maintien d’un potentiel antioxydant optimal. A titre d’exemple, la concentration plasmatique moyenne en vitamine C est de :
· 31,12 ± 14,88 mmol/L chez des sujets sains ne mangeant aucun fruit,
· 36,45 ± 18,79 mmol/L chez des sujets sains consommant entre 3 à 4 fruits par semaine,
· 48,83 ± 23,68 mmol/L chez des sujets sains consommant entre 1 et 4 fruits par jour (8).

Déterminer le statut de Stress Oxydant (SO) d'un individu devient actuellement un sujet de priorité en terme de prévention de maladies car de très nombreuses études (1) indiquent qu'il existe une association étroite entre l'altération des systèmes de défense antioxydants et le développement de plus de 200 pathophysiologies différentes allant de l’athérosclérose au cancer en passant par le SIDA, les maladies inflammatoires, le diabète et le vieillissement (figure 2).

figure 2 : pathologies dans lesquelles le stress oxydant est impliqué

II.Définition du stress oxydant

1.Le paradoxe de l'oxygène

La chaîne respiratoire mitochondriale joue un rôle capital dans la cellule en étant responsable de la transformation de l'oxygène en deux molécules d'eau. Cette réaction de réduction directe impliquant la présence de quatre électrons est rendue possible grâce à un système complexe de protéines et d'enzymes (cytochromes) localisés dans la membrane interne de la mitochondrie. Les conséquences de cette activité mitochondriale seront doubles et paradoxales. D'une part, la mitochondrie fournira à la cellule une source d'énergie importante puisque 36 molécules d'adénosine triphosphate (ATP) à haut potentiel énergétique seront générées lors de la réduction de l'oxygène. Par contre, environ 0,4 à 4% de l'oxygène ne seront pas correctement convertis en eau suite à des fuites électroniques résultant d'imperfections de la chaîne respiratoire mitochondriale. Par réduction monoélectronique, l'oxygène donnera naissance à des espèces oxygénées activées (EOA) parmi lesquelles figurent des radicaux libres comme l'anion superoxyde ou le radical hydroxyle (OH°.). En chimie, un radical libre est un atome ou une molécule dont la structure chimique est caractérisée par la présence d'un électron libre rendant cette espèce chimique beaucoup plus réactive que l'atome ou la molécule dont il (elle) est issu(e). D'autres entités non radicalaires de l'oxygène peuvent être produites comme le peroxyde d'hydrogène (H
2O2) ou l'oxygène singulet (1O2). La formation des EOA requiert la présence de métaux de transition comme le fer ou le cuivre qui agissent comme des catalyseurs incontournables dans toute la chimie des radicaux libres (figure 3).

figure 3 : description des espèces oxygénées activées

Notre organisme produit donc en permanence ces EOA (figure 3). L’avènement de la biologie moléculaire a permis de montrer que les EOA ont un rôle physiologique important en agissant à faible concentration comme des messagers secondaires capables :

- de réguler le phénomène d’apoptose qui est un suicide programmé des cellules évoluant vers un état cancéreux (2)
- d’activer des facteurs de transcription (NFkB, p38-MAP kinase, …) eux – mêmes responsables de l’activation de gènes impliqués dans la réponse immunitaire (3),
- de moduler l’expression de gènes de structure codant pour les enzymes antioxydantes (4).

Le revers de la médaille est que, si les EOA sont produites en quantité trop importante, elles auront des effets néfastes en induisant un phénomène d’apoptose dans des cellules saines ou en activant divers gènes codant pour l’expression de cytokines pro-inflammatoires ou de protéines d’adhésion. Par ailleurs, les EOA, de par leur nature instable, sont particulièrement réactionnelles et seront capables de provoquer des dégâts cellulaires importants :
· en provoquant des cassures et des mutations au sein de l’acide désoxyribonucléique (ADN),
· en inactivant des protéines et des enzymes,
· en oxydant les sucres (glucose),
· en induisant des processus de peroxydation lipidique au sein des acides gras polyinsaturés des lipoprotéines ou de la membrane cellulaire (figure 4).

figure 4 : destruction membranaire par attaque des EOA


2.Les défenses antioxydantes

L’équilibre entre les effets positifs et négatifs des EOA est donc particulièrement fragile. La production des EOA sera strictement régulée par notre organisme qui a développé des défenses antioxydantes pouvant nous protéger contre les effets potentiellement destructeurs des EOA. Ces systèmes se composent (figure 5) :
- d’enzymes (superoxydes dismutases Cu-Zn et Mn, catalase, glutathion peroxydases, couple thiorédoxine - thiorédoxine réductase, hème oxygénase, heat shock protéines),
- de protéines transporteuses du fer et du cuivre (transferrine, ferritine, céruléoplasmine),
- de molécules antioxydantes de petite taille (glutathion, acide urique, bilirubine, glucose, vitamines A, C, E, ubiquinone, caroténoïdes, flavonoïdes),
- d'oligo-éléments (cuivre, zinc, sélénium) indispensables pour l'activité des enzymes antioxydantes.
Un système de défense secondaire composé d'enzymes dont le rôle consiste à empêcher l'accumulation dans la cellule de protéines ou d'ADN oxydés et à dégrader leurs fragments toxiques, complète la panoplie des moyens de protection contre les EOA (figure 5).

figure 5: balance entre antioxydants et pro – oxydants


3.Facteurs contribuant à augmenter le stress oxydant

Un stress oxydant se définira comme étant un déséquilibre de la balance entre les antioxydants et les pro-oxydants en faveur de ces derniers (5). In vivo, plusieurs systèmes biochimiques peuvent être à l’origine d’une production accrue d’EOA. L’altération de la chaîne de transport des électrons dans la mitochondrie est une première cause de l’augmentation du stress oxydant. Ce phénomène se produit lors du processus du vieillissement ou de toute situation caractérisée par un phénomène d’ischémie – reperfusion (e.g. la transplantation d’organes). L’activation des globules blancs est également une source très importante de production d’EOA. Sous l’action d’agents étrangers, ces cellules passent d’un état quiescent à un état activé, ce qui se traduit par une augmentation de 400% de la consommation en oxygène. Divers systèmes enzymatiques transforment la quasi-totalité de l’oxygène en EOA qui peuvent alors s’attaquer à des tissus sains : c’est le phénomène de l’inflammation. D’autres systèmes entrent en ligne de compte dans la production massive d’EOA comme l’activation de la xanthine oxydase, l’oxydation de l’hémoglobine, la libération de fer libre, le métabolisme accru des prostaglandines ou encore l’activation des cellules endothéliales. Par ailleurs, de nombreuses études épidémiologiques indiquent que l'homocystéine constitue un facteur de risque cardiovasculaire indépendant pour l'infarctus du myocarde, les accidents vasculaires cérébraux ischémiques et la mortalité coronarienne. Parmi les mécanismes d’action de l'homocystéine pouvant favoriser l’apparition de l’athérosclérose, figure son effet cytotoxique direct sur les cellules endothéliales, en partie lié à la formation de radicaux libres lors de l'oxydation de l'homocystéine réduite par le fer (6, 7).

L’environnement dans lequel nous vivons mais aussi notre mode de vie sont à l’origine d’une augmentation du stress oxydant dans notre organisme. En voici quelques exemples :
- exposition prolongée au soleil
- exposition aux radiations
- contacts avec des agents cancérigènes (e.g. amiante)
- tabagisme (la fumée de cigarette contient 1019 EOA)
- prise de médicaments, pilule contraceptive
- pratique trop intense ou mal gérée d’un sport
- consommation excessive d’alcool
- stress intellectuel
- stress thermique
- ozonothérapie
- pollution
- agents infectieux
- ….

4.Une alimentation déséquilibrée : un facteur de stress oxydant important

Les antioxydants sont essentiellement apportés par les fruits et légumes qui sont particulièrement riches en vitamines (A, C, E), oligo – éléments et autres polyphénols. Actuellement, il est bien admis que les apports journaliers recommandés (AJR) en ces divers éléments peuvent être couverts par une prise quotidienne de cinq portions de fruits et légumes. Cette situation est toutefois loin de représenter la réalité puisque plusieurs enquêtes épidémiologiques indiquent que plus de 20% de la population des pays industrialisés ne mangent jamais de fruits. Dans une étude menée sur 123 sujets sains habitant la région liégeoise, nous avons confirmé ce chiffre et montré que les taux plasmatiques de vitamine C sont diminués en moyenne de 26,3% chez des sujets ne mangeant aucun fruit en comparaison à des personnes ingérant entre 1 et 4 fruits par jour (8). Par ailleurs, l’avènement du fast food (consommation régulière d’hamburgers, de pizzas, ..) contribue, tout particulièrement chez les jeunes, à avoir une alimentation de plus en plus déséquilibrée et appauvrie en antioxydants.

La figure ci - dessus montre l’importance que peut avoir une consommation importante en fruits et des légumes sur la réduction des taux cellulaires d’ADN oxydé (9) dont le rôle est bien démontré dans le développement du cancer (figure 6)

figure 6 : effet de l’alimentation sur l’oxydation de l’ADN


5.Utilité de mesurer son statut de stress oxydant

En 1991, l’étude Who Monica de l’Office Mondial de la Santé (OMS) montre qu’il existe une inégalité du risque coronarien chez des hommes selon qu’ils vivent dans des pays du Sud (alimentation riche en fruits) ou du Nord de l’Europe (alimentation plus pauvre). Les résultats montrent très clairement que plus les taux plasmatiques en vitamine C sont bas, comme c’est le cas dans les populations du Nord, plus les risques de mortalité coronarienne sont élevés (10). Ces observations sur la vitamine C ont été confirmées par la suite dans une grande enquête épidémiologique portant sur plus de 1600 sujets (figure 7)(11).

figure 7 : vitamine C et maladies cardiovasculaires

Dans leur grande majorité, les études épidémiologiques indiquent qu'il existe une association étroite entre l'altération des défenses antioxydantes, l’augmentation des marqueurs d’oxydation et le développement de plus de 200 pathophysiologies différentes allant de l’athérosclérose au cancer en passant par le SIDA, les maladies inflammatoires, le diabète et le vieillissement (figure 2). Potentiellement des apports complémentaires en antioxydants pourront donc s’avérer utiles dans la prévention de ces pathologies. Actuellement, il n’ y a pas encore d’ « evidenced based medicine » bien établie mais des résultats convergents d’études sur les antioxydants montrent leur intérêt potentiel en terme de prévention de maladies. Par exemple, des études récentes montrent que la vitamine E est capable de retarder la progression de l’athérosclérose carotidienne (12, 13).

Connaître son statut de stress oxydant (SS0) est donc utile en terme de prévention de maladies (14). Grâce aux développements de méthodes d'analyses spécifiques, sensibles, rapides et adaptées pour des dosages de routine, certaines sociétées offrent aux professionnels de la santé une large batterie de tests permettant d'évaluer l'état des défenses antioxydantes, le statut en oligo – éléments, le métabolisme du fer (agent catalytique des réactions conduisant à la formation d'EOA) mais aussi les marqueurs d'oxydation des lipides, protéines ou de l'ADN. Ceci permettra de déceler la présence d'un état de stress oxydant anormal chez un individu et, par conséquent, de le corriger par des conseils alimentaires ou un apport complémentaire approprié.
Cette mission s'inscrit dans le cadre d'une révolution scientifique qui, demain, orientera la démarche thérapeutique vers une application personnalisée, patient par patient. Ces outils d'analyse définiront notamment la réaction du génome pour chaque patient dans une situation de stress oxydant et permettront une évaluation très précise des capacités de réponse individuelle à ce stress.

III.Comment évaluer son statut de stress oxydant ?

Une seule méthode ne peut à elle seule rendre compte du SSO. Il importe donc d’avoir à sa disposition une batterie de tests adéquats afin d’évaluer exactement la situation (1). La détermination du SSO s’orientera autour de six grands axes d’analyses :

· 1. Antioxydants enzymatiques et de bas poids moléculaire

A. Les superoxydes dismutases (SOD's)

Cette enzyme assure l’élimination de l’anion superoxyde, première espèce toxique formée à partir de l’oxygène. Elle assure ainsi la première ligne de défense contre le stress oxydant. La SOD a besoin d’oligo-éléments comme le cuivre et le zinc (Cu-ZnSOD présente dans le cytosol) ou le manganèse (MnSOD présente dans la mitochondrie) pour fonctionner correctement. Il existe aussi une SOD extracellulaire.

Des valeurs basses en SOD peuvent s’expliquer par des taux faibles en oligoéléments. Il n’existe toutefois pas de corrélation absolue entre concentrations de SOD et ceux – ci. Face au stress oxydant, la SOD se comportera de deux façons différentes (figure 8). Dans un premier temps, l’organisme réagira lors d’un stress oxydant modéré en surexprimant la SOD (exemple : l’exercice physique) (15, 16). Si le stress perdure et produit de façon massive des EOA toxiques , la SOD sera détruite et sa concentration chutera. Paradoxalement, une concentration trop élevée en SOD peut s’avérer dangereuse car, dans ce cas, elle est à la base d’une surproduction de peroxyde d’hydrogène (effet paradoxal des antioxydants).

Concentrations normales sanguines : 785 – 1570 UI/g Hémoglobine

figure 8 : évolution des antioxydants enzymatiques
en fonction de l’intensité du stress oxydant

 

B. Les glutathion peroxydases (GPx)

Cette enzyme a besoin du glutathion et du sélénium pour fonctionner correctement. Son rôle principal est d’éliminer les peroxydes lipidiques résultant de l’effet du stress oxydant sur les acides gras polyinsaturés.

Tout comme la SOD, la glutahion peroxydase séléno-dépendante se comportera de deux façons différentes face au stress oxydant : surexpression de l’enzyme dans un premier temps puis destruction si le stress oxydant perdure de manière permanente . Une diminution de l’activité de la GPx peut également provenir d’un apport alimentaire trop faible en sélénium.

La relation entre sélénium plasmatique et GPx érythrocytaire n’est significative que lorsque la teneur en sélénium est inférieure à 60 µg/L (figure 9). Au dessus de cette valeur, la relation montre un plateau, indiquant que les besoins de l’enzyme sont satisfaits (17) .

figure 9 : relation entre l’activité de la GPx et
le taux plasmatique en sélénium

Concentrations normales sanguines : 30 – 55 UI/g hémoglobine

C. Les thiorédoxines (TRx) et la thiorédoxine réductase (TRxR)

Les thiorédoxines sont des enzymes à activité antioxydante intrinsèque comme toutes les protéines à groupement thiol (-SH). Elles jouent aussi un rôle important dans la régulation du système immunitaire (18, 19). Une fois oxydée, la thiorédoxine est réduite par la thiorédoxine réductase (TRxR) qui est une enzyme possédant un groupement sélénocystéine dans son site actif. La TRxR intervient aussi dans la dégradation des peroxydes lipidiques et du peroxyde d’hydrogène et dans la régénération du radical ascorbyl en acide ascorbique.

D. La hème oxygénase

Le système hème oxygénase (HO) est constitué de trois isoenzymes : la forme HO-1 inductible, la forme HO-2 constitutive et la forme HO-3 qui a été récemment clonée. Dans les systèmes biologiques, la HO permet la conversion de l’hème en monoxyde de carbone, en biliverdine et en fer. L’effet protecteur de la HO contre le stress oxydant est indirect puisqu’il est relié au fait que, une fois formée, la biliverdine se transforme en bilirubine qui possède de puissantes activités antioxydantes. Par ailleurs, le fer produit par l’activité de la HO stimule la synthèse de la ferritine qui est aussi impliquée dans la réponse antioxydante (action à long terme). Toutefois, l’activité de la HO peut avoir des effets nefastes à court terme puisque ce même fer agira comme agent pro - oxydant via son action catalytique de la production des EOA (20).

E. Les protéines de stress thermique

Cette famille de protéines chaperonnes (« heat shock proteins ») comme la HSP70 joue un rôle essentiel dans les processus de translocation, de stabilisation et d’assemblage des protéines. Elles interviennent aussi dans la réparation des dommages oxydatifs induits au niveau des protéines par un stress oxydant. Ces protéines permettent aux cellules de résister à un environnement hostile en prolongeant leur viabilité jusqu’à l’apparition de conditions plus favorables. L’augmentation de la synthèse de ces protéines doit donc être considérée comme un réponse d’adaptation au stress oxydant induit par différentes conditions : régulation thermique (hypothermie et hyperthermie), acidose, déplétion énergétique, phénomène d’ischémie – reperfusion, infection virale, exercice physique (21).


F. Les caroténoïdes

Par dégradation, certains caroténoïdes comme le ß- carotène servent de précurseurs à la vitamine A dont le rôle est primordial dans la perception visuelle. La plupart des caroténoïdes et vitamine A interagissent avec l’oxygène singulet et peuvent ainsi empêcher l’oxydation de plusieurs substrats biologiques dont les acides gras polyinsaturés.

Une déficience majeure en vitamine A ou rétinol est rare et ne s’observe que pour des valeurs inférieures à 10 mg/100 ml. Des valeurs basses (< 28,6 mg/100 ml chez l’enfant et < 40,1 mg/100 ml chez l’adulte) correspondent à un risque modéré de déficience en vitamine A. La célèbre étude WHO/MONICA menée dans 8 pays européens a montré que des concentrations en vitamine A supérieures à 63 - 80,2 mg/100 ml étaient associées avec un risque diminué d’apparition de maladies cardio-vasculaires (22).

Parmi d’autres caroténoïdes intéressants pour leurs propriétés antioxydantes, citons également le lycopène présent dans la peau de la tomate (23), la lutéine, le ß- cryptoxanthine, la zéaxanthine, …..

Concentrations normales plasmatiques en vitamine A: 1200 – 3700 UI/L ou 36,03 – 111 µg/dL
Concentrations normales plasmatiques en ß carotène 10 - 85 µg/dl
Concentrations normales plasmatiques en lycopène : 10 - 33 µg/dl


G. La vitamine C

La vitamine C ou acide ascorbique n’est pas synthétisée par l’organisme. Sa concentration plasmatique dépend fortement de l'alimentation et des modifications du flux hépatique (e.g . après un exercice physique). C’est un excellent piégeur des EOA qui peut protéger divers substrats biologiques (protéines, acides gras, ADN) de l’oxydation. Aux concentrations physiologiques, la vitamine C est capable d’empêcher l’oxydation des LDL produite par divers systèmes générateurs d’EOA (neutrophiles activés, cellules endothéliales activées, myéloperoxydase). Lors de son oxydation en acide déhydroascorbique, elle passe par une forme radicalaire intermédiaire (radical ascorbyl) qui joue un rôle essentiel dans la régénération de la vitamine E oxydée (figure 10).

figure 10 : lors de l’interaction des radicaux  lipidiques avec la vitamine E, celle – ci est  transformée en radical tocopheryl.  La vitamine C permet de régénérer le radical tocophéryl (vit E oxydée) formé en vitamine E active

Face à un stress oxydant, la vitamine C sera consommée. Plusieurs études ont par ailleurs montré que des valeurs de vitamine C inférieures à 4 mg/mL sont associées avec un risque accru de développement de maladies cardiovasculaires (10) (voir figure 8).

Malgré son caractère très labile, la vitamine C peut se doser en routine moyennant un traitement immédiat et approprié de l’échantillon sanguin.

Concentrations normales plasmatiques : 6,21– 15,18 µg/mL (hommes) ; 8,6– 18,8 µg/mL (femmes)

H. La vitamine E

Sous le terme vitamine E est regroupée la famille des tocophérols (alpha,beta,gamma,delta). Le caractère hydrophobe de la vitamine E lui permet de s’insérer au sein des acides gras de la membrane cellulaire et des lipoprotéines où elle joue un rôle protecteur en empêchant la propagation de la peroxydation lipidique induite par un stress oxydant (figure 11). De tous les tocophérols, ce sont l’alpha et le gamma (24) qui possèdent les propriétés antioxydantes les plus intéressantes.

figure 11 : insertion de la vitamine E au sein de la membrane lipidique.

La vitamine E sera consommée en réponse à un stress oxydant. Une valeur de vitamine E inférieure à 7 – 8 mg/ml correspond à un risque modéré de déficience en cette vitamine dans l’alimentation. L’étude européenne WHO/MONICA (10) a montré que les concentrations sanguines en vitamine E (standardisées par rapport au taux de cholestérol) sont significativement plus élevées chez des hommes en bonne santé (40-49 ans) vivant dans des régions d’Europe à faible mortalité coronarienne (Suisse, Italie du Sud) que chez ceux habitant dans des régions de moyenne (Irlande du Nord) et forte mortalité (Sud-Ouest de la Finlande, Ecosse).

La vitamine E étant transportée par les lipides, sa concentration doit toujours être standardisée par rapport au cholestérol (rapport VitE/Cholestérol) ou aux lipides totaux.

Concentrations normales plasmatiques en vitamine E : 8 – 15 µg/mL
Concentrations normales plasmatiques du rapport VitE/cholestérol : 4,40 – 7,00 µg/g

I. Le glutathion

Il s’agit d’un tripeptide qui joue un rôle à divers niveaux dans la lutte contre le stress oxydant. Le glutathion (GSH) peut interagir directement avec les espèces oxygénées activées mais il est principalement utilisé comme substrat de la glutathion peroxydase qui assure l’élimination des lipides peroxydés. Il joue également un rôle clé dans l’expression de gènes codant pour des protéines pro – et anti – inflammatoires (figure 12). Des concentrations trop basses en GSH conduisent à une diminution de la défense immunitaire .

figure 12 : rôle central du GSH dans la régulation de l’expression de gènes pro ou anti-inflammatoires

Lors d’un stress oxydant, le GSH est généralement consommé. Il importe donc de mesurer le glutathion oxydé (GSSG) et de calculer le rapport GSH/GSSG afin d’obtenir une idée plus précise de l’importance du stress oxydant. Jones et al (25) ont récemment montré que le vieillissement (> 50 ans) s’accompagne d’une diminution progressive de ce rapport. Ce rapport est aussi particulièrement diminué à l’issue d’un exercice physique intense (figure 13) suite à une augmentation du glutathion oxydé. Ceci reflète la présence d’un stress oxydant comme précédemment décrit (26).

 Figure 13 : Evolution du rapport GSH/GSSG lors d’un exercice physique intense


Concentrations normales sanguines en GSH : 753 – 958 µM
Concentrations normales sanguines en GSSG : 1,17 – 5,32 µM
Concentrations normales sanguines du rapport GSH/GSSG : 156 - 705

J. Les protéines thiols

La plupart des protéines possèdent des groupements thiols (-SH) qui réagissent très facilement avec les espèces oxygénées activées. Vu sa grande quantité, l’albumine qui possède des groupements thiols peut être considérée comme étant un des antioxydants majeurs du plasma. Ce test est complémentaire au dosage du GSH.

Concentrations normales plasmatiques : 216 – 556 µM

K. L’acide urique

L’acide urique constitue le produit terminal majeur du métabolisme des purines chez les primates. Possédant des propriétés antioxydantes, il peut interagir avec les espèces oxygénées activées, et tout particulièrement avec le radical hydroxyle. Il apparaît comme étant l’antioxydant plasmatique le plus efficace en terme de réactivité avec les EOA. Toutefois, ses produits d’oxydation comme l’allantoïne, peuvent facilement s’oxyder en générant à leur tour des espèces toxiques de l’oxygène.

L’acide urique augmente lors d’un stress oxydant, principalement lors de phénomènes d’ischémie – reperfusion.

Concentrations normales plasmatiques :valeur homme : 34 -84 mg/L femme : 22 - 60 mg/L

L. Le CoEnzyme Q10

L’ubiquinone ou CoQ10 est bien connu pour son rôle vital dans la production d’énergie au niveau de la mitochondrie. Le CoQ10, principalement sous sa forme réduite ubiquinol – 10 ou CoQ10H2, possède aussi des propriétés antioxydantes intéressantes puisque, tout comme la vitamine E, il est capable d’inhiber la peroxydation lipidique (27, 28). L’étude du rapport CoQ10H2/CoQ10 est nécessaire afin d’évaluer correctement l’importance du CoQ10 dans la protection contre l’agression par les EOA (29). D’autre part, l’évaluation du CoQ10 peut se révéler être un paramètre discriminant intéressant pour déceler des patients à risque de développer des problèmes coronariens (figure 14).

 

témoin

patients atteints
d’ischémie cardiaque

CoQ10 (µM)

0,86 +/- 0,28

0,70 +/- 0,19

LDL choles (mM)

3,21 +/- 0,84

3,81 +/- 0,92

Tot Choles/HDL choles

3,81 +/- 1,16


4,59 +/- 1,21

LDLcholes/CoQ10 x 10³

3,73 +/- 1,12

5,76 +/- 1,72

 

Figure 14 : Rapport LDL/CoQ10 chez des patients atteints de maladies cardiovaculaires d’origine schémique Hanaki et al. Clin Invest 71 :S112-115, 1993

Comme l’ont montré Ghirlanda et al (30), les taux circulants de CoQ10 sont fortement diminués (+/- 40%) par la prise de statines bien connues pour leur capacité à réduire le cholestérol. Les statines inhibent en effet la 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) réductase qui agit sur la production de mevalonate, substrat commun pour la synthèse du cholestérol et du CoQ10.

Concentrations normales plasmatiques : 0,40 – 1,2 µg/mL

M. La capacité antioxydante globale

Ce test consiste à évaluer la capacité que possèdent le sang complet ou le plasma à inhiber la production d’EOA générées par un système in vitro. Il s’agit donc d’une méthode de screening qui est la sommation des activités individuelles de chaque antioxydant présent dans ces milieux biologiques (31). Il existe plusieurs tests (LPIC, TEAC, FRAP, TRAP, ORAC, DCFH-DA*…) qui se différencient par le système producteur d’EOA, la cible biologique à oxyder et le système de détection. La littérature mentionne que l’essai TEA est le moins fiable. Depuis peu, des méthodes très rapides (dosage en quelques minutes) utilisant la chimioluminescence permettent de différencier spécifiquement la capacité antioxydante totale du plasma due aux antioxydants hydrophiles et lipophiles. Il convient toutefois d’être très prudent quant à l’interprétation du test car il reflète souvent le taux circulant en acide urique (ou d’albumine) qui est en fait l’antioxydant possédant la plus grande constante de réactivité avec les EOA. Chaque méthode a ses limites et, selon le choix de la méthode, la capacité antioxydante totale peut être sur - ou sous - estimée, voire même non corrélée aux conditions de stress oxydant.

·* LPIC : Lipid peroxidation inhibition capacity
· TEAC : Trolox equivalent antioxidant capacity
· FRAP : Ferric reducing antioxidant power
· TRAP : Total radical-trapping antioxidant potential
· ORAC : Oxygen radical absorbance capacity
· DCFH-DA : Dichlorofluorescein – diacetate assay


2. Les oligo-éléments

A. Le sélénium

Cet oligo-élément n’est pas en tant que tel un antioxydant mais il participe au processus de défense contre les EOA comme co-facteur de la glutathion peroxydase.

Plusieurs grandes études ont montré que des concentrations sériques en sélénium inférieures à 45 – 50 µg/L, sont associées avec l’apparition de pathologies coronariennes (32, 33, 34).

Concentrations normales plasmatiques : 94 – 130 µg/L
(Rem :La concentration sérique en sélénium est 1,18 plus élevée que sa concentration plasmatique.)

B. Le cuivre

Cet oligo-élément est un des co-facteurs essentiels de la SOD. Toutefois, au même titre que le fer, il joue, en tant que métal dit de transition, un rôle important dans le déclenchement des réactions conduisant à la formation d’espèces oxygénées activées. Une concentration trop élevée en cuivre pourra donc refléter la présence d’un stress oxydant. Plusieurs études ont montré une augmentation du taux sérique en cuivre au cours du processus de vieillissement (35).

Concentrations normales plasmatiques : 0,70 à 1,40 mg/L

C. Le zinc

Cet oligo-élément est un des co-facteurs essentiels de la SOD. La prise de zinc conduit à long terme à l’induction de protéines antioxydantes comme les métallothioneines. Le zinc protège également les groupements thiols des protéines. Le zinc peut inhiber partiellement les réactions de formation d’espèces oxygénées induites par le fer ou le cuivre. A ce titre, l’analyse du rapport sanguin cuivre/zinc peut donner des indications intéressantes sur l’état de stress oxydant d’un individu.

Un déficit en zinc résulte généralement en une sensibilité plus accrue au stress oxydant. Une étude récente a montré que les personnes âgées atteintes de maladies dégénératives ont un rapport cuivre/zinc plus élevé que des personnes âgées en bonne santé (36).

Concentrations normales plasmatiques du zinc : 0,70 – 1,20 mg/L
Concentrations normales plasmatiques du rapport cuivre/zinc : 1,14 – 1,29


· 3. Les marqueurs biologiques de stress oxydant

Les EOA réagissent avec toute une série de substrats biologiques comme les protéines, les lipides ou l’acide désoxyribonucléique (ADN). La mise en évidence de dérivés d’oxydation de ces différents substrats seront donc des marqueurs de la présence d’un stress oxydant.

A. La peroxydation lipidique

Les acides gras polyinsaturés des membranes cellulaires sont la cible principale des EOA. Il en résulte la formation de peroxydes lipidiques (LP0) qui peuvent se mesurer dans le plasma ou le sang total avec certaines limites de sensibilité et de spécificité (37). Les LPO se décomposent toutefois en sous – produits comme la malonaldéhyde (MDA), le 4-hydroxynonénal, l’éthane ou le pentane. Pendant de nombreuses années, la détermination de la MDA par l’acide thiobarbiturique (TBARS méthode) a été utilisée pour évaluer in vivo la présence d’une peroxydation lipidique. Il est toutefois bien admis par la communauté scientifique que ce test n’est pas spécifique et est sujet à de très nombreux artéfacts. Il est possible maintenant de mesurer la MDA par des techniques HPLC plus précises. Il est toutefois bon de rappeler que la MDA ne représente qu’un faible pourcentage (1%) du processus de décomposition des peroxydes lipidiques, et à ce titre, elle est donc loin d’être un marqueur fiable de la présence d’un stress oxydant.

Les EOA peuvent aussi interagir directement avec les acides gras pour former de la 8-epi-prostaglandine PGF 2a appartenant à la famille des isoprostanes. La concentration de ces molécules est, par exemple, fortement augmentée dans le plasma ou l’urine des fumeurs chroniques (38) par rapport à des sujets non fumeurs (figure 15).

figure 15 : les isoprostanes comme marqueurs de la peroxydation lipidique

  

Les acides gras polyinsaturés sont aussi les constituants essentiels des LDL (« low density lipoproteins »). L’oxydation des LDL est un processus particulièrement important dans le processus du développement de l’athérosclérose. Par rapport à une population témoin, des études récentes montrent que les taux de LDL oxydées sont particulièrement élevés chez des patients atteints d’un infarctus du myocarde (39) . De façon générale, les patients à haut risque de développer des accidents cardiovasculaires (hypertension, hypercholestérolémie, obésité, dialysés rénaux) présentent des taux anormaux en LDL oxydées (figure 16). La méthode de mesure spectrophotométrique des LDL oxydées basée sur la détermination des diènes conjugués est moins sensible et moins spécifique en comparaison aux méthodes immunologiques récemment développées.

Concentrations normales plasmatiques en LDL oxydées : 26 – 117 U/L

figure 16 : les LDL oxydées comme facteur de risques cardiovasculaires chez des patients dialysés

L’oxydation des LDL se traduit par l’expression du titre d’anticorps contre les LDL oxydées (Ab-ox-LDL). Plusieurs études ont montré que l’augmentation de la concentration en anticorps est étroitement associée avec la progression de l’athérosclérose carotidienne (40, 41, 42). Des titres particulièrement élevés en anticorps se retrouvent régulièrement chez les sportifs de haut niveau (43) qui représentent le modèle in vivo par excellence de stress oxydant (figure 17).

figure 17: taux d’anticorps contre les LDL oxydées chez des sportifs de haut niveau (Pincemail et al. Free Rad Biol Med 28 :559-565, 2000)


Concentrations normales sériques en anticorps contre les LDL oxydées : 200 – 600 UI/L


B. Les protéines oxydées

En présence d’EOA, les protéines peuvent se dénaturer, se fragmenter ou perdre leurs structures primaire et secondaire. Les dommages oxydatifs au niveau des protéines (et des acides aminés) peuvent se manifester de diverses manières (44, 45) :
- apparition de groupements hydroperoxydes (-OOH),
- oxydation du squelette carboné de la chaîne polypeptidique conduisant à une fragmentation des protéines et à l’apparition de groupements carbonyles,
- oxydation des chaînes latérales des acides aminés avec formation de ponts disulfure, de méthionine sulfoxyde et de groupements carbonyles. Certains acides aminés (Phe, Tyr, His) subissent un processus d’ hydroxylation qui génère la formation d’ortho - et de méta - tyrosine dans le cas de la Phe. Lors de l’oxydation de la Tyr, il y a dimérisation de deux radicaux tyrosyl conduisant à la formation de dityrosine.
- formation de dérivés chlorés (e.g. 3 –chlorotyrosine, 3,5-dichlorotyrosine) et nitrés (nitrotyrosine) lors du contact de la tyrosine avec respectivement, le système MPO/H
202 et le radical de l’oxyde nitrique (NO°).

La mise en évidence de groupements carbonyles dans les protéines oxydées est de loin la technique qui est la plus utilisée (46). Toutefois, l’apparition de ces groupements reflète plutôt une modification globale dans la protéine et n’est sans doute pas aussi spécifiquement représentative de la présence d’un stress oxydant que la détection de Tyr hydroxylée.

Concentrations plasmatiques normales

C. La 8-hydroxy-2’déoxyguanosine

Les EOA ont une grande affinité de réaction avec certaines bases constitutives de l’ADN. La guanine est ainsi facilement transformée en 8-hydroxy-2’-déoxyguanosine (8-OH-dG) qui est normalement éliminée par des enzymes de réparation de l’ADN. Si ces systèmes sont défaillants, la 8-OH-dG s’accumulera au sein de l’ADN (figure 18) causant ainsi des mutations impliquées dans le développement du cancer (47). La concentration de la 8-OH-dG doit être standardisée par rapport à la créatinine lorsqu’elle est mesurée dans les urines.

figure 18 : effet de l’environnement sur l’oxydation de l’ADN

 

Valeurs normales urinaires : 0 – 20 µg 8OH-dG/gr créatinine (dosage selon test ELISA)

· 4. Le statut en fer

Le fer joue un rôle de catalyseur dans la formation des EOA. En situation physiologique, il n’est pas présent sous une forme libre responsable de cet effet néfaste. L’analyse des protéines transporteuses du fer sera donc un élément important dans l’établissement du SSO. Un grand nombre de travaux suggèrent l’implication des métaux de transition comme le fer ou le cuivre dans le développement de l’athérosclérose (48).

A. Le fer libre

Le fer sérique mesuré dans les bilans sanguins classiques représente le pool de fer lié aux protéines et à d’autres agents chélateurs comme les pyrophosphates. Il ne s’agit donc pas du fameux fer libre toxique (49, 50) qui peut se mesurer en routine moyennant quelques contraintes techniques. En situation physiologique, le fer libre n’est pas décelable.

Concentrations normales plasmatiques en fer libre : 0 µmol/L

B. La ferritine

Cette protéine représente le site majeur de stockage du fer intracellulaire non métabolisé et joue en conséquence un rôle primordial en régulant la disponibilité du fer libre qui est l’agent catalyseur des réactions conduisant à la formation d’espèces oxygénées activées. Plusieurs études ont montré qu’une augmentation des taux de ferritine (notamment au niveau de la peau) constituait une réponse adaptative au stress oxydant (51).

Concentrations normales plasmatiques : 30 – 300 ng/mL (homme) ;15 – 150 ng/mL (femme)

C. La transferrine et sa capacité de saturation en fer

En situation physiologique, la transferrine est saturée entre 25 et 30% en fer. Toute augmentation par rapport à ces valeurs indiquera que du fer a été libéré sous une forme libre. A titre d’exemple, une circulation extracorporelle (CEC) utilisée au cours de pontages coronariens induit une libération importante de fer suite à l’hémolyse des globules rouges. Plusieurs travaux ont montré que le coefficient de saturation en fer de la transferrine augmente progressivement au cours de la CEC jusqu’à atteindre des valeurs de 80 à 90%, ce qui est associé avec une augmentation des marqueurs de stress oxydant (52, 53).

Concentrations normales plasmatiques en transferrine : 1,60 – 3,50 g/L
Capacité normale de saturation en fer de la transferrine : 20 – 40%

· 5. Le radical du monoxyde d’azote

Ce radical particulier dérivé de l’azote (NO°) est produit par les cellules endothéliales et joue un rôle physiologique primordial dans la régulation de la pression sanguine. Un stress oxydant peut toutefois conduire à un mauvais fonctionnement des cellules endothéliales qui produiront alors un excès de radical du monoxyde d’azote. Ce dernier pourra réagir avec des radicaux libres oxygénés pour former des substances particulièrement toxiques pour l’organisme, les peroxynitriques (HOONOH).

Une fois formé, le NO peut aussi évoluer vers des nitrites ou des nitrates dont l’augmentation du rapport des concentrations plasmatiques reflète la production du monoxyde d’azote. Le NO pourra également interagir avec les protéines au niveau de leur groupement tyrosine (phénomène de nitration) ou avec le gamma tocophérol. Ces propriétés seront mises à profit pour déceler la présence de NO dans des échantillons biologiques (54, 55).

· 6. La résonance paramagnétique électronique (RPE)

Il s’agit de la technique de choix pour visualiser de la manière la plus directe possible les radicaux libres. Ces derniers sont en effet caractérisés par la présence d’un électron libre qui, en tournant sur lui – même comme une toupie, induit un champ magnétique (figure 19). Si le radical libre est placé dans un champ magnétique produit par deux puissants aimants, il en résultera une absorption d’énergie qui pourra être visualisée sous la forme d’un spectre. Le signal obtenu sera une sorte d’empreinte pour chaque type de radical.

figure 19 : appareil de RPE permettant la visualisation la plus directe possible de radicaux libres oxygénés

 

D’autre part, son intensité sera directement proportionnelle à la quantité de radicaux libres présents dans l’échantillon biologique analysé, de sorte qu’il sera possible d’obtenir une mesure quantitative de la production de radicaux libres. Moyennant quelques contraintes techniques non insurmontables (utilisation de « piégeurs de spin » ou « spin trap »), la RPE peut être utilisée dans la routine clinique pour la détection de la production d’anion superoxyde dans un échantillon plasmatique.

La RPE est capable de déceler dans le plasma le radical ascorbyl (figure 20) qui est une forme intermédiaire radicalaire entre l’acide ascorbique et son produit final oxydé, l’acide déhydroascorbique. La mesure du radical ascorbyl est intéressante car elle permettra de déterminer si des taux bas en vitamine C sont dus à un mauvais apport alimentaire en cet antioxydant ou à la présence d’un stress oxydant. Si une concentration plasmatique faible en vitamine C est associée avec un rapport vitC/radical ascorbyl situé dans des valeurs normales, ceci indiquera un apport faible en vitamine. Par contre, si des taux de vitamine C (même normaux) sont associés avec un rapport vitC/radical ascorbyl bas, ceci signera la présence d’un stress oxydant (56).

Figure 20 : spectre RPE du radical ascorbyl

Concentrations normales plasmatiques en radical ascorbyl: 0,28 – 0,44 unités arbitraires*
Concentrations normales plasmatiques du rapport VitC/radical ascorbyl : 20,73 – 39,29
(* mesure réalisée sur un Jeol FR300)

7. Autres marqueurs

A. L’ homocystéine

L'homocystéine est un acide aminé soufré qui est un intermédiaire dans le métabolisme de la méthionine et de la cystéine (figure 21). Bien que de nombreux laboratoires renseignent des valeurs normales d’homocystéine comprises entre 5 et 15 µmol/L, des études prospectives récentes ont montré que des taux d’homomocystéine supérieurs à 6,3 µmol/L se traduisaient par une augmentation de 35% de l’infarctus du myocarde (figure 22) (57). Chaque augmentation de 5 µmol/l d'homocystéine, ce qui est l'équivalent à une augmentation de 20 mg/dL de cholestérol plasmatique, accroît le risque de maladie coronarienne de 60 % chez l'homme et de 80 % chez la femme. L’homocystéine est aussi fort sensible à l’oxydation et génère des EOA qui peuvent oxyder les LDL, particulièrement en présence de métaux comme le fer ou le cuivre (6).

Concentrations normales plasmatiques : 5 – 15 µmol/L

 

figure 21 : métabolisme de l’homocystéine

figure 22 : relation homocystéine/maladie cardiovasculaire



B. Le glucose

Par auto - oxydation, le glucose produit de grandes quantités d’EOA et de glyoxal (figure 23). Ce dernier se fixe sur le groupement amine des protéines avec comme conséquence l’apparition de résidus carboxyméthyl-lysine (« protéines âgées »). Ceux – ci ont la capacité de fixer le cuivre et d’induire un processus de peroxydation lipidique, ce qui entraîne une augmentation de la production de glyoxal. Le glucose lui – même peut se combiner à l’hémoglobine pour donner l’hémoglobine glycosylée. Une augmentation de ces marqueurs se retrouve bien sûr chez des patients souffrant de diabète, pathologie clairement associée à une situation très importante de stress oxydant (58). Toutefois, ces marqueurs peuvent aussi s’accumuler dans l’organisme lors du processus de vieillissement.

figure 23 : interaction glucose – espèces oxygénées activées

Concentrations normales plasmatiques : 0,60 à 1,10 g/L

C. La myéloperoxydase

Les neutrophiles qui subissent un processus d’activation augmentent leur consommation d’oxygène de 400% avec comme conséquence une production massive d’EOA et une libération d’enzymes protéolytiques (élastase) et de myéloperoxydase (MPO). Cette dernière est impliquée dans le développement d’un stress oxydant puisque son activité enzymatique est responsable de la formation d’acide hypochloreux, agent puissamment oxydant. Une augmentation de la MPO plasmatique sera donc un témoin spécifique de la présence d’une activation des neutrophiles et donc indirectement de la production d’EOA, ce qui se retrouve dans tout phénomène inflammatoire (59).

Concentrations normales plasmatiques : 170 – 498 µg/L

D. Le profil des acides gras

Notre alimentation contient de grandes quantités d’acides gras polyinsaturés de type w6 (acides linoléique et arachidonique). En présence d’EOA, ces molécules s’oxydent facilement pour former des peroxydes lipidiques. De plus, la biosynthèse de ces acides gras conduit à la formation de prostaglandines pro-inflammatoires (figure 24). Notre alimentation est par contre plus pauvre en poisson, qui contient, à l’inverse de la viande, beaucoup d’acides gras polyinsaturés de type w3 (acides alphalinoléique et docosahéxaénoïque). Ceux – ci sont moins facilement peroxydables et leur biosynthèse donne naissance à des prostaglandines de type anti-inflammatoires. Les scientifiques s’accordent pour dire que le rapport total w6/w3 ne doit pas dépasser une valeur de 4 à 8/1, ce qui est loin d’être le cas dans nos populations occidentales. De Lorgeril et al ont montré qu’une alimentation crétoise riche en acide alpha – linolénique permettait de réduire de plus de 70% le taux de récidives cardiovasculaires chez des patients ayant subi un infarctus du myocarde (60).

figure 24 : biosynthèse des acides gras polyinsaturés

 

 

IV. Quel est le meilleur marqueur pour évaluer le stress oxydant ?

La réponse à cette question est très simple : il n’y en a pas.

Dès le début des recherches sur le stress oxydant, les scientifiques ont été obnubilés par la découverte d’un marqueur biologique qui identifierait à coup sûr la présence d’un stress oxydant dans diverses situations expérimentales ou cliniques. La mesure de la malonaldéhyde (MDA), comme marqueur de l’oxydation des lipides, a été pendant très longtemps considérée comme le test de référence. Malheureusement, la détection de la MDA utilisant l’acide thiobarbiturique (TBARs) manquait de spécificité et était surtout sujet à de nombreux artéfacts. Sur base de ce simple test, de très nombreuses erreurs d’interprétation ont été commises, ce qui a parfois jeté le discrédit sur l’importance du stress oxydant en médecine humaine. Il faudra attendre le milieu des années 80 pour voir l’utilisation de nouvelles techniques plus fiables destinées à mettre en évidence un stress oxydant in vivo. Actuellement plus de 80 dosages sont potentiellement susceptibles d’être proposés dont seulement une bonne trentaine sont réalisables dans les conditions usuelles de la routine clinique. Chaque méthode, quelle qu’elle soit, a toujours ses propres spécificités et limites. C’est pourquoi il reste utopique de vouloir déceler un stress oxydant sur la base d’une seule analyse, même si celle – ci est présentée au corps médical d’une manière attractive quant à sa rapidité d’exécution. Il importe de ne pas retomber dans les erreurs du passé commises avec le dosage de la MDA.

Une connaissance approfondie de la littérature scientifique s’avère donc nécessaire pour garder un esprit critique sur tous ces moyens d’investigation (61). Evaluer correctement un statut de stress oxydant ne pourra donc se réaliser que sur base d’une batterie de tests qui se complèteront l’un l’autre. Les créneaux d’investigation reposent principalement sur :
1° l’analyse des antioxydants
2° la détermination d’oligo – éléments
3° la mise en évidence de dommages oxydatifs au niveau des lipides, des protéines, des lipoprotéines, de l’ADN et du glucose.
4° le métabolisme du fer.

Toutefois, le médecin est très souvent bien désarmé quant au choix des dosages à réaliser.. L’expertise scientifique et clinique a en effet montré que certains marqueurs se révèlent être plus parlants que d’autres selon les situations physiologiques ou pathologiques envisagées. Certains proposent donc des bilans sanguins de stress oxydant regroupant un ensemble de dosages bien précis et adaptés à diverses maladies dans lesquelles le stress oxydant est impliqué (brevet déposé).

V. Traitement immédiat des échantillons et chaîne du froid : deux éléments indispensables pour obtenir des résultats de qualité


L’interprétation des bilans de stress oxydant proposés doit reposer impérativement sur un traitement des échantillons sanguins particulièrement soigné. La grande majorité des dosages proposés pour évaluer le stress oxydant sont en effet très sensibles aux conditions de préservation des échantillons (type d’anticoagulant, température, ..). Un exemple en est donné avec la détermination du glutathion réduit et du glutathion oxydé. La figure 25 montre comment évoluent ces deux marqueurs si leur analyse est réalisée 1 heure ou plus après une conservation du sang à température ordinaire. Dans ce cas précis, seules la mise en contact immédiate du sang avec des stabilisateurs et la congélation immédiate des échantillons (T0) permettront d’obtenir une analyse de qualité et interprétable.

figure 25 : évolution du rapport GSH/GSSG dans des échantillons sanguins maintenus entre 1 et 24 heures à température ambiante.T0 : échantillon traité immédiatement après la prise de sang Rectangle bleu : intervalle de référence

De façon générale, ces observations sont également valables pour l’ensemble des marqueurs pouvant refléter la présence d’un stress oxydant. La figure 26 montre que la cinétique de conservation des lipoprotéines oxydées (LDL oxydées) est très fluctuante, même dans des échantillons de sang complet conservés à +4°C. La seule condition pour obtenir un résultat fiable est de centrifuger immédiatement l’ échantillon sanguin puis de congeler le plasma à – 20°C.

Figure 26 : évolution de la concentration en LDL oxydées (U/L) en fonction du temps

 

Rappelons que lorsque des scientifiques publient des résultats sur l’évolution de marqueurs plasmatiques du stress oxydant (e.g. la vitamine E), ils sont tenus de préciser dans la partie « matériel et méthodes » de l’article que les échantillons de sang ont été immédiatement centrifugés et que le plasma a ensuite été conservé à –20°C jusqu’au moment de l’analyse du dudit marqueur. X SA entend respecter scrupuleusement ces consignes et met donc à la disposition des utilisateurs un protocole très détaillé concernant le prélèvement et le traitement des échantillons sanguins ainsi que leur acheminement sur carboglace dans des boites appropriées vers le laboratoire.

VI. Développements futurs : la génomique et la protéomique

X SA investit aussi beaucoup d’efforts dans le développement de ces nouveaux outils afin de mieux comprendre l’implication du stress oxydant dans le développement de diverses maladies. Par rapport aux analyses classiques, ces méthodes pourront mieux nous renseigner sur l’origine du stress oxydant et sur le type d’organe plus spécifiquement confronté à une surproduction d’EOA.

Un des développements le plus récent mais le plus passionnant dans le domaine du stress oxydant est la découverte montrant que l’expression des gènes et des protéines est régulée de manière différente en réponse au stress oxydant. La technique de la real time-PCR (« real time – polymerase chain reaction) consiste à transformer en ADNc de l’ARN isolé de cellules à l’aide d’une transcriptase inverse. L’ADNc du gène spécifiquement étudié est ensuite amplifié à l’aide de deux amorces et d’une polymérase. La détection de l’amplification se fera en temps réel par une sonde spécifique fluorescente. Plus récemment, les puces à ADN (« microarray ») ont fait leur apparition avec l’avantage de permettre en une seule fois la visualisation des différences d’expression entre plusieurs centaines de gènes codant pour le stress oxydant (62) et ceci à l’échelle du génome humain complet. La fabrication de la puce consiste à déposer sur une lame en verre des fragments d’ADNc (correspondant aux gènes étudiés) qui ont été préalablement amplifiés par la technique de PCR (« polymerase chain reaction »). L’ADNc est ensuite dénaturé afin de se retrouver sous forme de simple brin, ce qui lui permettra de s’accrocher au brin complémentaire contenu dans la sonde ou la cible étudiée (cellules, morceaux de tissus, etc..). A partir de cellules soumises ou non (témoin) à un stress oxydant (traité), de l’ARN est extrait pour être transformé en ADNc par une transcriptase inverse. L’ADNc des cellules témoins est marqué avec un agent fluorescent vert tandis que l’ADNc des cellules soumises à un stress oxydant est marqué avec un fluorochrome rouge. L’étape de l’hybridation consistera à mélanger les ADN des deux cellules et à les placer sur la puce. Celle – ci sera incubée une nuit à 42°C afin de permettre à un brin d’ADNc de la sonde de s’apparier avec son brin complémentaire déposé sur la puce pour donner de l’ADNc double brin. Le scan de la lame après hybridation donnera des valeurs d’intensité de fluorescence correspondant aux signaux verts et rouges. Le rapport signal rouge/signal vert donnera une valeur de 1 si l’ARN d’un gène d’intérêt est en quantité égale dans les conditions témoin et traité. Si la valeur est supérieure à 1, cela signifie qu’il y a eu une sur - expression du gène tandis qu’une valeur inférieure à 1 indiquera une sous – expression du gène (figure 27).

Figure 27 : principe des puces à ADN

 

 


VII.Conclusions

Il est actuellement bien admis que les EOA provoquent des dommages cellulaires importants pouvant conduire à des défaillances au sein d’un organe. Dans cette optique, le stress oxydant est de plus en plus impliqué dans le processus du vieillissement, l’apparition de complications cliniques ou le développement de maladies associées au vieillissement (athérosclérose, cancer, maladies neurodégénératives). Un champ d’investigation important est donc en train de s’ouvrir dans le domaine du diagnostic du stress oxydant et de thérapies permettant de limiter ses effets néfastes. Si elle est bien appliquée, cette nouvelle discipline devrait révolutionner la médecine de demain et avoir un impact économique important en terme de soins de santé. Pour cela, il convient de disposer d’outils d’analyses performants et spécifiques. Alors que les premières études de laboratoire sur le stress oxydant étaient uniquement basées sur la détermination de la malonaldéhyde comme marqueur in vivo de la peroxydation lipidique, ces cinq dernières années ont vu une véritable explosion des méthodes susceptibles d’évaluer le statut de stress oxydant (SSO) d’un individu en routine clinique. Chaque méthode sans exception a ses limites et ne peut donc à elle seule refléter un SSO. Il sera donc nécessaire d’utiliser des batteries de tests mais de manière appropriée car le stress oxydant se manifestera de façon différente selon la situation physiologique ou pathologique envisagée.. Centrifuger les échantillons sanguins immédiatement après le prélèvement mais également maintenir une chaîne du froid pour les plasmas ou autres sera jusqu’à l’analyse des échantillons sont deux contraintes (non insurmontables) qui sont les principales garanties de résultats de qualité (voir charte qualité ). Ceci permettra de donner la meilleure interprétation possible des résultats qui se fera sur la base d’une expérience scientifique universitaire de plus de 20 ans dans le domaine du stress oxydant.

L’outil de recherche décrit dans ce fascicule permettra, par exemple, aux professionnels de la santé de déceler chez leurs patients la présence éventuelle de concentrations anormales en antioxydants et de les corriger par une meilleure alimentation ou par un apport complémentaire approprié. Toutefois, l’avènement des techniques de génomique et de protéomique dans lesquelles X SA s’investit dans son département R&D, modifiera considérablement notre compréhension du stress oxydant et devrait permettre d’apporter de meilleures corrections individualisées permettant de réduire les effets néfastes du stress oxydant.


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